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【技術(shù)在線】HCP ELISA方法驗(yàn)證——稀釋線性dilution linearity

前言

HCP ELISA檢測(cè)方法必須要通過(guò)法規(guī)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)方法(ICHFDA指南進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,以確保其能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確的結(jié)果。要獲得準(zhǔn)確的HCP ELISA檢測(cè)結(jié)果,本質(zhì)上要保證樣品中HCP的濃度高于試劑盒的定量下限(LOQ,同時(shí)HCP的檢測(cè)抗體還要處于過(guò)剩狀態(tài),滿(mǎn)足這兩點(diǎn)就必須要對(duì)檢測(cè)樣品(過(guò)程樣品最終的藥物原液)進(jìn)行稀釋線性驗(yàn)證。因此,稀釋線性(dilution linearity)是驗(yàn)證HCP ELISA方法特異性和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)之一。在HCP檢測(cè)中,稀釋線性不佳的原因主要有兩種:一種是樣品中某些HCPs的抗體過(guò)剩條件不滿(mǎn)足,需要通過(guò)進(jìn)一步稀釋來(lái)達(dá)到“最小必要稀釋倍數(shù)”(MRD);另一種是產(chǎn)品蛋白本身或產(chǎn)品配方緩沖液中的某些成分對(duì)HCP的檢測(cè)產(chǎn)生干擾,可以采用指定的樣品稀釋液(見(jiàn)文末)或者緩沖液置換等方式處理樣品來(lái)滿(mǎn)足檢測(cè)需求。關(guān)于樣品稀釋液,最優(yōu)的選擇是使用和標(biāo)準(zhǔn)品相同的稀釋液。Cygnus針對(duì)每種ELISA檢測(cè)方法都提供了相應(yīng)的樣品稀釋液,以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。對(duì)于使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的用戶(hù),我們建議將可接受的稀釋線性定義為“在倍稀釋時(shí),校正后的HCP濃度變化不超過(guò)±20%”。同時(shí),還要避免檢測(cè)值靠近定量下限,即稀釋樣品HCP檢測(cè)值不能低于定量下限的兩倍。接下來(lái),本文將為您詳細(xì)解讀HCP ELISA方法學(xué)驗(yàn)證中有關(guān)線性稀釋的操作方法與注意事項(xiàng)

 

為什么要建立稀釋線性?

在測(cè)試一個(gè)新的宿主細(xì)胞蛋白(HCP)ELISA方法時(shí),建立稀釋線性是第一項(xiàng)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)目的是確認(rèn)所選擇的HCP ELISA是否適用于您過(guò)程樣品藥物原液中的HCPs。當(dāng)稀釋線性確認(rèn)后,進(jìn)一步的分析驗(yàn)證提供所需的實(shí)驗(yàn)條件信息,因此稀釋線性通常是最先進(jìn)行的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

 

具體來(lái)講,稀釋線性實(shí)驗(yàn)目的是確定ELISA方法對(duì)樣品中HCPs的反應(yīng)曲線和全定量范圍。成功驗(yàn)證了稀釋線性意味著對(duì)存在于樣品的各種HCPs,抗體過(guò)剩條件已滿(mǎn)足,且樣品基質(zhì)不會(huì)影響HCP的定量,從而保證HCP ELISA檢測(cè)結(jié)果的可靠。

 

如何進(jìn)行稀釋線性實(shí)驗(yàn)?

在進(jìn)行ELISA分析之前,任何可能超過(guò)定量上限ULOQ)的樣品都應(yīng)該先進(jìn)行稀釋線性實(shí)驗(yàn)。過(guò)程包括:驗(yàn)證過(guò)的樣品稀釋液對(duì)HCP待檢樣品進(jìn)行多個(gè)梯度稀釋?zhuān)?/span>然后對(duì)這些稀釋樣品進(jìn)行檢測(cè),并計(jì)算每個(gè)稀釋樣品中校正后的HCP濃度(即測(cè)得的HCP濃度×稀釋倍數(shù))。大多數(shù)情況下,在達(dá)到一定稀釋倍數(shù),稀釋樣品校正后的HCP濃度值會(huì)出現(xiàn)相對(duì)恒定狀態(tài),那么稀釋倍數(shù)被稱(chēng)為“最低需求稀釋度”(MRD)。

1 最低需求稀釋度(MRD)

 

如下表案例,樣品在高濃度(未稀釋1:2,1:4稀釋)時(shí)并未顯示出良好的稀釋線性,但隨著進(jìn)一步稀釋?zhuān)?/span>我們可以確定一個(gè)MRD,在此稀釋度實(shí)現(xiàn)了可接受的稀釋線性(見(jiàn)下表藍(lán)色行)。按照定義,當(dāng)校正HCP濃度在2稀釋之間變化范圍不超過(guò)±20%時(shí),即達(dá)到了可接受的稀釋線性,同時(shí)避免靠近定量下限,稀釋樣品HCP檢測(cè)值不能低于定量下限的兩倍(在這個(gè)案例中1:64稀釋樣品HCP檢測(cè)值<2倍LOQ,因此未計(jì)入統(tǒng)計(jì)。變化百分比可以通過(guò)減去前一稀釋樣品濃度的校正值,然后將差值除以前一個(gè)稀釋樣品濃度的校正值來(lái)計(jì)算。例如,1:2稀釋樣品相較未稀釋樣品的變化百分比為:[(233-146)/146]x100%=60%。

樣品稀釋梯度

HCP稀釋校正

(ng/mL)

一個(gè)稀釋樣品

的變化百分比

未稀釋

146

NA

1:2

233

60%

1:4

312

34%

1:8

361

16%

1:16

356

1%

1:32

370

4%

1:64

未計(jì)算

(<2倍LOQ)

NA

表中數(shù)據(jù)我們可以得出結(jié)論,該樣品的MRD為1:4,那么最終計(jì)算出HCP濃度應(yīng)在MRD以下(或等于)和LOQ以上所有校正后HCP濃度的平均值(在此例中,應(yīng)取312、361、356和370的平均值350ng/mL)。

在實(shí)際應(yīng)用中我們應(yīng)當(dāng)對(duì)需要檢測(cè)HCP的所有樣品類(lèi)型(包括過(guò)程樣品以及最終的藥物原液)進(jìn)行稀釋線性評(píng)估,并將每種樣品類(lèi)型和基質(zhì)的MRD值以及稀釋不同樣品的具體指導(dǎo)納入到SOP文件中。

 

稀釋線性不佳的原因與解決方法

對(duì)HCP ELISA檢測(cè),可能會(huì)出現(xiàn)某些HCPs稀釋線性不佳的情況,也就是樣品存在某些HCPs的抗體過(guò)剩條件滿(mǎn)足。例如,個(gè)別高濃度的HCP可能對(duì)該特定HCP的抗體產(chǎn)生飽和,出現(xiàn)鉤子效應(yīng)high-dose hook effect”,從而導(dǎo)致該HCP的定量不準(zhǔn)確

圖2 鉤子效應(yīng)(high-dose hook effect)示意圖

此外,某些伴隨蛋白(hitchhiker proteins)可能會(huì)產(chǎn)物蛋白相互作用,并在純化過(guò)程中顯著富集,從而完全干擾整個(gè)分析的線性。

3. 伴隨蛋白(hitchhiker proteins)與產(chǎn)物蛋白相互作用干擾分析線性

其他導(dǎo)致稀釋線性不佳的原因還有可能是產(chǎn)品配方(或過(guò)程樣品的緩沖溶液)中的某些成分干擾了檢測(cè),對(duì)于Cygnus HCP ELISA試劑盒,已知的干擾因素包括極端pH、洗滌劑、有機(jī)溶劑、高蛋白濃度和高鹽濃度等,因此我們建議樣品的稀釋一定使用和標(biāo)準(zhǔn)品相同的稀釋液,詳見(jiàn)下表

貨號(hào)

品名

應(yīng)用

規(guī)格

I028

樣品稀釋液

適用于大部分HCP試劑盒,如CHO(F550-1),E.coli(F1020, F410

100 ml, 500 ml, 1000 ml

I700

樣品稀釋液

適用于HEK 293 HCP(F650S)試劑盒

100 ml, 500 ml, 1000 ml

I094

樣品稀釋液

適用于MDCK(F800)和HeLa(F810)HCP試劑盒

100 ml, 500 ml, 1000 ml

I600

樣品稀釋液

適用于大部分Mix-N-Go系列Protein A檢測(cè)試劑盒(F600, F610, F740, F910, F950)和核酸內(nèi)切酶殘留檢測(cè)試劑盒(F960)

25 ml, 100 ml

F031A

樣品稀釋液

適用于BSA(F030)檢測(cè)試劑盒

100 ml, 500 ml, 1000 ml

I800

樣品稀釋液

適用于PROchievA? Protein A(F965)試劑盒

25 ml, 100 ml

F223A

樣品稀釋液

適用于NS/0 HCP(F220)試劑盒

100 ml, 500 ml, 1000 ml

F233A

樣品稀釋液

適用于A549 HCP(F230)試劑盒

100 ml, 500 ml

F213A

樣品稀釋液

適用于山羊IgG(F210)檢測(cè)試劑盒

100 ml, 500 ml, 1000 ml

F243A

樣品稀釋液

適用于山羊乳總蛋白(F230)檢測(cè)試劑盒

100 ml, 500 ml, 1000 ml

Cygnus不同生物工藝雜質(zhì)檢測(cè)試劑盒對(duì)應(yīng)的樣品稀釋液一覽

最后,我們?cè)俅螐?qiáng)調(diào),只有在抗體過(guò)剩的情況下,劑量反應(yīng)曲線才會(huì)呈正斜率,檢測(cè)結(jié)果才是準(zhǔn)確的。

如果稀釋線性不佳的因素是由HCP抗體不足樣品基質(zhì)干擾,那么隨著樣品的稀釋倍數(shù)增加,其測(cè)得的HCP濃度會(huì)呈現(xiàn)上升趨勢(shì),因此需要通過(guò)進(jìn)一步稀釋樣品來(lái)達(dá)到MRD如果是其他原因,也可以通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟來(lái)提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。如果增加樣品的稀釋倍數(shù)仍無(wú)法解決稀釋線性不佳的問(wèn)題,則可能是純化過(guò)程存在問(wèn)題。

 

Cygnus針對(duì)每一種檢測(cè)試劑盒均提供相應(yīng)的QS(Qualification Summary)文件,如有需求歡迎點(diǎn)擊這里填寫(xiě)信息索取,或者聯(lián)系Cygnus中國(guó)總代理西美杰。如果您在Cygnus HCP ELISA試劑盒的使用中遇到了稀釋線性相關(guān)問(wèn)題且無(wú)法通過(guò)上述方法解決的,歡迎您隨時(shí)聯(lián)系西美杰,我們的技術(shù)支持會(huì)針對(duì)您的問(wèn)題提供相應(yīng)解決方法和建議。接下來(lái)我們還會(huì)陸續(xù)分享一系列關(guān)于HCP ELISA方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容,包括加標(biāo)回收以及HCP抗體適用性驗(yàn)證等,敬請(qǐng)關(guān)注

 

 

Cygnus Technologies專(zhuān)注為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過(guò)25年,旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒,用于檢測(cè)超過(guò)50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專(zhuān)注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測(cè)的高靈敏度分析技術(shù)的專(zhuān)家,其產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被全球超過(guò)95%以上生物制藥公司使用,并獲得FDA、NMPA、EMA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可。

北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國(guó)總代理,與國(guó)內(nèi)眾多知名藥企,CRO/CMO企業(yè)建立了長(zhǎng)久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來(lái)西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段,提高藥物質(zhì)量、純度和安全,加速優(yōu)化研發(fā)工藝,減少產(chǎn)品上市時(shí)間,降低QC成本。如您對(duì)上述產(chǎn)品感興趣,歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網(wǎng)站m.njhbqp.cn了解更多信息。


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